유 , Liu, 이, Lee, 김, Kim, 정, and Jeong: Evaluation of the Performance of ASTA MicroIDSys, a Novel Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry System, in Identification of Bacterial Clinical Isolates

Changseung Liu1*Eunjung Lee2*Dokyun Kim1Seok Hoon Jeong1

1Department of Laboratory Medicine and Research Institute of Bacterial Resistance, Yonsei University College of Medicine, SeoulKorea
2Department of Clinical Pathology, Sangji University College of Science,Wonju,Korea


*Corresponding author:Tel: +82-2-2019-2776 ,Fax: +82-2-2057-8926 E-mail: kyunsky@yuhs.ac


ABSTRACT

Background:We evaluated the performance of ASTA MicroIDSys (ASTA, Korea) and Bruker Biotyper (Bruker Daltonics, Germany) systems in the identification of bacterial isolates from clinical microbiology laboratory specimens during the study period. In addition, species for which the identification accuracy using MALDI-TOF MS systems was previously reported to be poor were also identified by comparing the MS results with those obtained using molecular identification.

Methods:A total of 889 non-duplicated clinical isolates were included in this study. The results of ASTA MicroIDSys were compared with those of Bruker Biotyper; 16S rRNA sequencing was performed for the species for which results obtained using the two systems did not match. The sequences of rpoB , hisA, and/or recA for the clinical isolates of Acinetobacter species, Klebsiella species, and Burkholderia cepacia complex were analyzed and used as reference identifications.

Results: The concordance rates for bacterial identification using ASTA MicroIDSys and Bruker Biotyper were 100% at the genus level and 98.3% at the species level for isolates belonging to the order Enterobacterales. Similarly, the concordance rates at the genus and species levels were 98.8% and 91.0% for glucose non-fermenting bacilli, 100% and 100% for gram-positive cocci, and 98.9% and 98.9% for other isolates, respectively. ASTA MicroIDSys was expected to correctly identify 97.9% of the 108,251 isolates identified in our clinical microbiology laboratory over the past 5 years.

Conclusion:ASTA MicroIDSys showed excellent performance in bacterial identification for most of the clinically relevant species. Further extension of the database could improve the identification accuracy of ASTA MicroIDSys.

Keywords



INTRODUCTION

정확하고 신속한 원인균의 동정은 감염증의 진단과 치료에 필수적이며 환자의 생존과 예후에 영향을 미치는 중요한 인자이다[1]. 임상미생물 검사실에서 통상적으로 시행되는 균종 동정법 은 그람 염색성과 형태와 생화학적 반응을 확인하는 시험법이다. 이러한 균종 동정 시험법은 시 간이 오래 걸리고, 검사자의 높은 전문성이 요구된다. 또한, 노령 환자와 면역억제환자의 증가로 감염병에서 분리되는 균종이 다양해져 정확한 균종 동정이 더욱 어려워지고 있다[2-4]. 전통적인 방법을 통해 정확한 균종 동정에 실패한 경우 분자진단검사를 시행할 수 있으나[5], 검사 과정에 노력과 비용이 많이 들며, 균종간 염기서열의 차이가 적은 경우 균종별 표적유전자로 추가적인 분석을 해야하는 경우가 있어 임상미생물 검사실에서 일상적으로 시행하기에는 적합하지 않다 [6,7].

말디토프 질량분석기(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)는 이온화된 검체가 진공관을 통과하여 검출기에 도달하는 시간을 측정하여 구성 단백의 질량을 분석하는 방법이다[8]. MALDI-TOF MS는 세균의 단백 발현에 대한 스펙트 럼 프로파일을 만들 수 있으며, 세균의 단백질 정보를 바탕으로 한 데이터베이스와 비교하여 균 종을 동정한다. 기존 연구에 의하면 전통적인 생화학적 자동화 장비가 균종 동정에 걸리는 시간 은 약 300-480분이었던 반면에 MALDI-TOF MS는 6분 이내에 균종 동정 결과를 보고할 수 있었 고, 비용도 22-32%에 불과하였다[9,10]. 또한 Streptococcus 균속과 Enterobacter 균속, Burkholderia cepacia complex (BCC)를 비롯한 일부 포도당 비발효 그람음성 막대균들은 세균의 단백질 정보의 부족, 또는 균종간 단백 성분의 유사성으로 정확한 균종 동정이 어렵다고 하였으나[11-14], 최근 에는 장비의 해상도와 데이터베이스가 개선되어 대부분의 균속에 대해 균종 수준까지의 정확한 동정이 가능하다고 보고되었다[15]. 따라서, MALDI-TOF MS는 생화학적 성상을 기반으로 하는 전통적 동정법과 일치율이 높고, 술식이 간단하고 신속한 균종 동정이 가능하여 임상미생물 검 사실에서 유용하게 사용될 것으로 기대되고 있다[16].

ASTA MicroIDSys (ASTA, Suwon, Korea)는 최근에 새로 개발된 미생물 균종 동정용 MALDITOF MS장비이다. 2,000에서 20,000 m/z의 분석 범위를 갖는 선형 MALDI-TOF MS 장비와 2,537 종의 균종 및 8,600개의 스펙트럼 정보가 포함된 데이터베이스(버전 1.26.02 기준), 정확도를 높 이기 위해 균종의 피크 수를 자동으로 선택하는 알고리즘이 적용된 분석 소프트웨어가 일체형 으로 구성되어 있고, 다양한 규격의 플레이트를 사용하여 한번에 96에서 384개의 시료를 빠르게 분석할 수 있는 것으로 알려져 있다. 기존에 임상미생물 검사실에서 가장 널리 사용되는 Bruker Biotyper (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)와 비교하였을 때, 산소성 세균과 진균 및 무산소성 세균에 대해서도 높은 동정 일치율이 보고된 바 있다[17-19]. 본 연구에서는 연구 기간 동안 임상미생물 검사실에서 실제 분리되는 세균을 대상으로 ASTA MicroIDSys와 Bruker Biotyper의 균 종 동정 정확도를 평가하였다. 또한, MALDI-TOF MS의 균종 동정 결과가 부정확한 것으로 알려 진 균속에 대한 균종 동정 정확도를 평가하였다. 마지막으로, 일반적인 검사실 환경에서 ASTA MicroIDSys의 유용성과 한계를 평가하고자 하였다.

MATERIALS AND METHODS

대상 균주

2019년 7월부터 9월까지 국내의 한 대학병원에서 분리된 임상분리주 전수를 연구에 포함 하였다. 해당 균주는 Escherichia coli 159주와 Klebsiella 균속 136주, Staphylococcus 균속 130주, Acinetobacter 균속 119주, Enterobacter 균속 84주, Enterococcus 균속 69주, Candida 균속 44주를 포 함한 889주였으며, 각 균주를 네 그룹(장내세균(Enterobacterales), 포도당 비발효 그람음성 막대균, 그람양성 알균, 기타)으로 분류하였다.

MALDI-TOF MS 균종 동정

순수 배양된 세균 집락을 이용하여 ASTA MicroIDSys와 Bruker Biotyper를 통해 균종을 동정 하였으며, 직접 도말법으로 동일하게 시험하였다. 즉, 혈액 한천 배지에 18시간 배양한 세균 집 락을 나무 막대를 이용하여 metal plate에 직접 도말하고 말린 후, 70% formic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 1.5 μL를 점적하여 상온 건조시켰다. 매트릭스 용액(50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid 에 포화된 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) 1.5 μL를 떨어뜨리고 말린 후 장비에 장착하여 검사를 시행하였다. ASTA MicroIDSys는 데이터베이스 버전 1.26.02를 이용하여 분석 하였고, Bruker Biotyper는 Biotyper 3 소프트웨어와 라이브러리 버전 6903을 사용하였다. MALDITOF MS의 미생물 동정 결과는 장비에 수록된 데이터베이스의 표준 질량스펙트럼과 시료인 세 균 단백의 질량스펙트럼을 비교한 값인 동정 스코어(ID score)로서 표현된다. ASTA MicroIDSys의 경우 동정 스코어 140 이상은 동정 결과의 신뢰도가 높음을, 130 미만은 동정 결과의 신뢰도가 낮 음을 의미하며, 그 사이의 스코어는 균종 및 균속 동정 결과에 대한 확인이 필요함을 의미한다. 마 찬가지로 Bruker Biotyper에서는 동정 스코어가 2.30 이상일 경우 확실한 균종 동정 결과, 1.70 미 만일 경우 신뢰할 수 없는 동정 결과로 정의되어있다. 본 연구에서 균종 동정 결과는 동일한 조건 하에서의 분석 결과를 비교하기 위해 두 장비 모두 최초 검사 결과를 보고하였다. 따라서 해당 장 비가 보고하는 균종 결과에 대해 동정 스코어를 확인하여 ASTA MicroIDSys 기준 130이상, Bruker Biotyper 1.70 이상인 경우에는 장비의 결과를 그대로 보고하였고, 동정 스코어가 이보다 낮은 경 우에도 재검을 시행하지는 않았다.

분자진단검사를 통한 균종 동정

ASTA MicroIDSys의 결과와 Bruker Biotyper의 결과가 일치하지 않은 균주 및 임상적으로 흔하 지 않은균종에 대하여 16S rRNA 염기서열 분석을 시행하여 균종을 확정하였다. 또한, 정확한 균 종 확인을 위해, Acinetobacter 균속 및 Klebsiella 균속은 rpoB 유전자, BCC 균주는 hisArecA 유전자에 대한 염기서열 분석을 추가적으로 시행하였다. 염기서열 분석 대상 균주의 DNA는 Cica geneus DNA extraction reagent ST (Kanto chemical, Tokyo, Japan)를 사용하여 추출하였다. 16S rRNA는 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)와 1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′), rpoB 유전자 는 Ac696F (5′-TAYCGYAAAGAYTTGAAAGAAG-3′)와 Ac1093R (5′-CMACACCYTTGTTMCCRTGA-3′), hisA 유전자는 A-442F (5′-AGGACCCGGCGGCGAT-3′)와 A-442R (5′-TGCAGCATCCCGTCGCG-3′), recA 는 BCR1 (5′-TGACCGCCGAGAAGAGCAA-3′)과 BCR2 (5′-CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC-3′)를 시발 체(primer)로 사용하였다[20-22]. 중합효소연쇄반응(PCR)은 C1000 Touch thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 수행하였으며, 95℃로 2분동안 DNA를 변성시키고, 95℃ 30초, 67℃ 45초, 72℃ 1분 1회로 하여 30회 시발체와 결합시킨 후, 72℃에서 10분간 증폭시켰다. 합성된 유전자의 염기서열은 ABI 3730xL DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 해독 하였으며, 분석된 염기서열은 EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net)의 type strain database 및 Basic Local Alignment Search Tool (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)과 대조하여 동정 결과를 확인하였다[23].

결과 분석

대상 균주에 대한 비교의 기준이 되는 균종명(reference identification)은 두 장비의 결과가 일치 한 경우 그 결과를 기준 균종명으로 하였고, 두 장비의 결과가 불일치할 경우 분자진단검사를 통 한 균종 동정을 시행하여 기준 균종명을 구하였다. 본 연구에서는 모든 시험 대상 균주에 대해 다 음과 같은 4가지로 결과를 분류 하였다: (1) 균종 일치(correctly identified - species level), (2) 균속 일 치(correctly identified - genus level), (3) 균속명까지 불일치한 경우: misidentification, (4) 적절한 동정 결과를 보고하지 못한 경우(ASTA MicroIDSys 균종 동정 점수<130, Bruker Biotyper 균종 동정 점 수<1.70): invalid identification. 또한, 균종명이 해당 장비의 데이터베이스에 없는 경우 별도 표시하 여 데이터베이스의 충실성을 비교하였다. 마지막으로, 실제 임상미생물 검사실에서 지난 5년간 Bruker Biotyper를 통해 보고된 균종 동정 결과에 ASTA MicroIDSys 데이터베이스의 균종 포함 여 부 및 균종별 일치율을 대입하였다. 이를 통해 해당 기간동안 ASTA MicroIDSys를 이용하여 동일 한 검사를 시행하였을 경우 동일한 균종 동정 결과가 예상되는 균주의 비율을 분석하였다

RESULTS

장내세균 균주에서의 ASTA MicroIDSys의 균종 동정 정확도

장내세균은 총 418주였으며, 균속 및 균종 일치율은 ASTA MicroIDSys에서 각각 100% (418/418), 98.3% (411/418), Bruker Biotyper에서는 각각 99.5% (416/418), 98.6% (412/418)였다(Table 1). ASTA MicroIDSys는 misidentification 및 invalid identification은 관찰되지 않았으며, Klebsiella variicola 2주와 Enterobacter asburiae 2주, Klebsiella aerogenes 1주, Enterobacter hormaechei 1주, Raoultella planticola 1주에서 균속 일치를 보였다. 이 중 K. aerogenes 1주를 제외한 나머지 6주는 데이터베 이스에 해당 균종 스펙트럼이 존재하지 않았다. Bruker Biotyper 역시 misidentification은 없었으 나, Klebsiella pneumoniae 1주와 Proteus mirabilis 1주에서 invalid identification을 보여주었으며, K.variicola 1주, K. aerogenes 1주, E. hormaechei 1주 및 R. planticola 1주에서 균속 일치의 결과를 보여 주었다.

Table 1

Comparison of bacterial identification between ASTA MicroIDSys and Bruker Biotyper for 418 Enterobacterales isolates

Reference identification (number of isolates) ASTA MicroIDSys, number of isolates Bruker Biotyper, number of isolates
Correctly identified Mis-ID Invalid-ID Correctly identified Mis-ID Invalid-ID
Genus level Species level Genus level Species level
Escherichia
E. coli (159) 159 159 159 159
E. hermannii (1) 1 1 1 1
Klebsiella
K. pneumonia (122) 122 122 121 121 1
K. oxytoca (12) 12 12 12 12
K. variicola (2) 2 0* 2 1
Enterobacter
E. cloacae (45) 45 45 45 45
E. aerogenes (36) 36 35 36 35
E. asburiae (2) 2 0† 2 2
E. hormaechei (1) 1 0* 1 0
Citrobacter
C. freundii (7) 7 7 7 7
C. koseri (1) 1 1 1 1
Raoultella
R. ornithinolytica (8) 8 8 8 8
R. planticola (1) 1 0* 1 0
Proteus
P. mirabilis (5) 5 5 4 4 1
P. vulgaris (1) 1 1 1 1
Other Enterobacterales
Serratia marcescens (6) 6 6 6 6
Salmonella enterica (5) 5 5 5 5
Providencia stuartii (2) 2 2 2 2
Cronobacter sakazakii (1) 1 1 1 1
Morganella morganii (1) 1 1 1 1
Total number of isolates (%) 418 (100) 411 (98.3) 416 (99.5) 412 (98.6) 2 (0.5)

*The protein spectra of the species were not included in the database.

E. asburiae were reported as E. cloacae complex by ASTA MicroIDSys.

Abbreviation: Mis-ID, misidentification; Invalid-ID, invalid identification.

포도당 비발효 그람음성 막대균에서의 ASTA MicroIDSys의 균종 동정 정확도

ASTA MicroIDSys에서의 균속 및 균종 일치율은 98.8% (165/167), 91.0% (152/167)였으며 invalid identification이 2주(1.2%) 있었고 misidentification은 없었다(Table 2). Bruker Biotyper의 균속 및 균종 일치율은 99.4% (166/167), 88.0% (147/167)였고 invalid identification이 1주(0.6%) 있었으며 misidentification은 없었다. ASTA MicroIDSys는 Acinetobacter johnsonii 1주와 Chryseobacterium massiliae 1주의 동정 결과를 내지 못하였으며, Acinetobacter seifertii 3주와 Acinetobacter soli 2 주, Acinetobacter 14TU 1주, Acinetobacter grimontii 1주, Acinetobacter gyllenbergii 1주, Acinetobacter oleivorans 1주, Acinetobacter venetianus 1주, Burkholderia cepnocepacia 2주, Burkholderia cepacia 1 주에서 균속 일치를 보였다. Bruker Biotyper의 경우 Acinetobacter nosocomialis 28주 중 1주에서 invalid identification을 보였으며, 5주는 균속 일치를 보였다. 이외에도 A. seifertii 3주, A. soli 2주, A.14TU 1주, A. grimontii 1주, A. gyllenbergii 1주, A. oleivorans 1주, A. venetianus 1주, B. cepacia 2주, B. cepnocepacia 1주, C. massiliae 1주에서 균속 일치를 보였다. Burkholderia 균속의 경우 두 장비 모두 균속명은 정확히 동정하였으나, 균종 일치율은 62.5% (5/8)에 불과하였다.

Table 2

Comparison of bacterial identification between ASTA MicroIDSys and Bruker Biotyper for 167 glucose non-fermenting bacilli isolates

Reference identification (number of isolates) ASTA MicroIDSys, number of isolates Bruker Biotyper, number of isolates
Correctly identified Mis-ID Invalid-ID Correctly identified Mis-ID Invalid-ID
Genus level Species level Genus level Species level
Acinetobacter
A. baumannii (47) 47 47 47 47
A. nosocomialis (28) 28 28 27 22 1
A. pitti (13) 13 13 13 13
A. bereziniae (8) 8 8 8 8
A. haemolyticus (4) 4 4 4 4
A. ursingii (4) 4 4 4 4
A. seifertii (3) 3 0* 3 0*
A. radioresistens (2) 2 2 2 2
A. soli (2) 2 0* 2 0*
A. 14TU (A. colistiniresistens) (1) 1 0* 1 0*
A. baylyi (1) 1 1 1 1
A. grimontii (1) 1 0* 1 0*
A. gyllenbergii (1) 1 0* 1 0*
A. johnsonii (1) 0 0 1 1 1
A. lwoffii (1) 1 1 1 1
A. oleivorans (1) 1 0 1 0*
A. venetianus (1) 1 0* 1 0*
Pseudomonas
P. aeruginosa (23) 23 23 23 23
Stenotrophomonas
S. maltophilia (13) 13 13 13 13
Burkholderia
B. cenocepacia (4) 4 2 4 3
B. cepacia (4) 4 3 4 2
Other GNFB
Chryseobacterium massiliae (1) 0 0 1* 1 0*
Chryseobacterium gleum (1) 1 1 1 1
Chryseobacterium indologenes (1) 1 1 1 1
Moraxella catarrhalis (1) 1 1 1 1
Total number of isolates (%) 165 (98.8) 152 (91.0) 2 (1.2) 166 (99.4) 147 (88.0) 1 (0.6)

*The protein spectra of the species were not included in the database.

Abbreviation: Mis-ID, misidentification; Invalid-ID, invalid identification.

그람양성 알균에서의 ASTA MicroIDSys의 균종 동정 정확도

그람양성 알균 216주에 대해 ASTA MicroIDSys는 균속명까지 모두 일치하는 동정 결과를 보였 다. Bruker Biotyper는 Streptococcus pneumoniae 1주에서 invalid identification을 보여, 균속 및 균종 일 치율은 99.5% (216/215)였다(Table 3).

Table 3

Comparison of bacterial identification between ASTA MicroIDSys and Bruker Biotyper for 216 Gram-positive cocci isolates

Reference identification (number of isolates) ASTA MicroIDSys, number of isolates Bruker Biotyper, number of isolates
Correctly identified Mis-ID Invalid-ID Correctly identified Mis-ID Invalid-ID
Genus level Species level Genus level Species level
Staphylococcus
S. aureus (45) 45 45 45 45
S. epidermidis (42) 42 42 42 42
S. capitis (9) 9 9 9 9
S. haemolyticus (8) 8 8 8 8
S. lugdunensis (8) 8 8 8 8
S. caprae (6) 6 6 6 6
S. hominis (5) 5 5 5 5
S. pasteuri (3) 3 3 3 3
S. saprophyticus (2) 2 2 2 2
S. simulans (1) 1 1 1 1
S. warneri (1) 1 1 1 1
Enterococcus
E. faecium (45) 45 45 45 45
E. faecalis (20) 20 20 20 20
E. avium (1) 1 1 1 1
E. casseliflavus (1) 1 1 1 1
E. gallinarum (1) 1 1 1 1
E. raffinosus (1) 1 1 1 1
Streptococcus
S. agalactiae (5) 5 5 5 5
S. pneumoniae (3) 3 3 2 2 1 1
S. anginosus (2) 2 2 2 2
S. constellatus (1) 1 1 1 1
S. dysgalactiae (1) 1 1 1 1
S. gallolyticus (1) 1 1 1 1
S. pyogenes (1) 1 1 1 1
S. salivarius (1) 1 1 1 1
Other Gram-positive cocci
Lactococcus lactis (1) 1 1 1 1
Micrococcus luteus (1) 1 1 1 1
Total number of isolates (%) 216 (100) 216 (100) 215 (99.5) 215 (99.5) 1 (0.5)

Abbreviation: Mis-ID, misidentification; Invalid-ID, invalid identification.

기타 균주에서의 ASTA MicroIDSys의 균종 동정 정확도

Candida 균속을 비롯한 효모형 진균과 Corynebacterium striatum등의 그람양성 막대균, Bacteroides fragilis 등의 혐기성 세균이 포함된 기타 균속들의 동정 결과에서는 ASTA MicroIDSys 의 균속 및 균종 일치율은 모두 98.9% (87/88)였으며, Bruker Biotyper의 균속 및 균종 일치율은 각 각 98.9% (87/88), 97.7% (86/88)였다(Table 4). Nocardia nova는 두 장비 모두 invalid identification의 결 과를 보여주었으며, Bruker Biotyper는 Neisseria macacae 1주에 대하여 균속 일치를 보여주었다.

Table 4

Comparison of bacterial identification between ASTA MicroIDSys and Bruker Biotyper for 88 other isolates

Reference identification (number of isolates) ASTA MicroIDSys, number of isolates Bruker Biotyper, number of isolates
Correctly identified Mis-ID Invalid-ID Correctly identified Mis-ID Invalid-ID
Genus level Species level Genus level Species level
Candida
C. albicans (18) 18 18 18 18
C. tropicalis (16) 16 16 16 16
C. glabrata (6) 6 6 6 6
C. krusei (2) 2 2 2 2
C. parapsilosis (2) 2 2 2 2
Corynebacterium
C. striatum (11) 11 11 11 11
C. tuberculostrearicum (2) 2 2 2 2
C. accolens (1) 1 1 1 1
Others
Elizabethkingia meningoseptica (6) 6 6 6 6
Saccharomyces cerevisiae (2) 2 2 2 2
Actinomyces neuii (1) 1 1 1 1
Actinomyces odontolyticus (1) 1 1 1 1
Aeromonas caviae (1) 1 1 1 1
Bacillus pumilus (1) 1 1 1 1
Bacteroides fragilis (1) 1 1 1 1
Brevibacterium casei (1) 1 1 1 1
Campylobacter jejuni (1) 1 1 1 1
Clostridioides difficile (1) 1 1 1 1
Clostridium innocuum (1) 1 1 1 1
Eggerthella lenta (1) 1 1 1 1
Eikenella corrodens (1) 1 1 1 1
Finegoldia magna (1) 1 1 1 1
Haemophilus influenza (1) 1 1 1 1
Leuconostoc lactis (1) 1 1 1 1
Neisseria macacae (1) 1 1 1 0
Nocardia nova (1) 0 0 1* 0 0 1
Paenibacillus amylolyticus (1) 1 1 1 1
Pichia norvegensis (1) 1 1 1 1
Prevotella intermedia (1) 1 1 1 1
Propionibacterium avidum (1) 1 1 1 1
Rothia mucilaginosa (1) 1 1 1 1
Vibrio parahaemolyticus (1) 1 1 1 1
Total number of isolates (%) 87 (98.9) 87 (98.9) 1 (1.1) 87 (98.9) 86 (97.7) 1 (1.1)

*Strains not in the database of the instrument.

Abbreviation: Mis-ID, misidentification; Invalid-ID, invalid identification.

두 장비 간 불일치가 발생한 균주

총 889주의 균주 중 Acinetobacter species에서 17주, Burkholderia species에서 6주, Klebsiella species 에서 4주, Enterobacter species에서 3주, 그리고 Chryseobacterium speciesNeisseria species, Nocardia species, Proteus species, Raoultella species, Streptococcus species에서 각각 1주씩의 불일치가 확인되 었다(Table 5). ASTA MicroIDSys에서 발생한 불일치 균주는 총 23건이었으며, 이 중 17건(73.9%)은 데이터베이스에 포함되지 않은 균종이었다.

Table 5

List of bacterial identification differences between ASTA MicroIDSys and Bruker Biotyper

Group Reference identification ASTA MicroIDSys Bruker Biotyper
Results ID score Results ID score
Enterobacterales Enterobacter asburiae Enterobacter cloacae† 220 Enterobacter asburiae 1.771
Enterobacter asburiae Enterobacter cloacae† 172 Enterobacter asburiae 2.109
Enterobacter hormaechei Enterobacter cloacae* 146 Enterobacter cloacae 2.193
Klebsiella (Enterobacter) aerogenes Klebsiella pneumoniae 213 Klebsiella variicola 2.238
Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae 258 Invalid Identification 1.663
Klebsiella variicola Klebsiella pneumoniae* 223 Klebsiella variicola 2.138
Klebsiella variicola Klebsiella pneumoniae* 211 Klebsiella pneumoniae 1.879
Proteus mirabilis Proteus mirabilis 236 Invalid Identification 1.270
Raoultella planticola Raoultella ornithinolytica* 214 Raoultella ornithinolytica 2.331
Glucose non-fermenting bacilli Acinetobacter 14TU (A. colistiniresistens) Acinetobacter junii* 188 Acinetobacter parvus* 1.895
Acinetobacter nosocomialis Acinetobacter baumannii complex (nosocomialis) 155 Acinetobacter baumannii 2.049
Acinetobacter nosocomialis Acinetobacter baumannii complex (nosocomialis) 226 Acinetobacter baumannii 1.718
Acinetobacter nosocomialis Acinetobacter baumannii complex (nosocomialis) 198 Acinetobacter baumannii 1.985
Acinetobacter nosocomialis Acinetobacter baumannii complex (nosocomialis) 174 Acinetobacter baumannii 1.911
Acinetobacter nosocomialis Acinetobacter baumannii complex (nosocomialis) 164 Acinetobacter baumannii 2.027
Acinetobacter nosocomialis Acinetobacter baumannii complex (nosocomialis) 159 Invalid Identification 1.667
Acinetobacter grimontii Acinetobacter junii* 253 Acinetobacter junii* 2.166
Acinetobacter gyllenbergii Acinetobacter junii* 181 Acinetobacter junii* 1.851
Acinetobacter johnsonii Invalid Identification - Acinetobacter johnsonii 2.265
Acinetobacter oleivorans Acinetobacter baumannii complex (pittii) 145 Acinetobacter calcoaceticus* 1.833
Acinetobacter seifertii Acinetobacter baumannii complex (pittii) * 133 Acinetobacter pittii* 1.941
Acinetobacter seifertii Acinetobacter baumannii complex (nosocomialis) * 161 Acinetobacter baumannii* 1.994
Acinetobacter seifertii Acinetobacter nosocomialis* 144 Acinetobacter pittii* 1.888
Acinetobacter soli Acinetobacter baylyi* 176 Invalid Identification* 1.670
Acinetobacter soli Acinetobacter baylyi* 195 Acinetobacter baylyi* 1.821
Acinetobacter venetianus Acinetobacter haemolyticus* 189 Acinetobacter haemolyticus* 2.190
Burkholderia cepacia Burkholderia cepacia 215 Burkholderia cenocepacia 1.880
Burkholderia cenocepacia Burkholderia cepacia 184 Burkholderia cenocepacia 2.115
Burkholderia cenocepacia Burkholderia ambifaria 182 Burkholderia cenocepacia 2.106
Burkholderia cepacia Burkholderia cenocepacia 201 Burkholderia cepacia 2.232
Burkholderia cenocepacia Burkholderia cenocepacia 194 Burkholderia cepacia 2.169
Burkholderia cepacia Burkholderia cepacia 199 Burkholderia seminalis 2.102
Chryseobacterium massiliae Invalid Identification* - Chryseobacterium species* 1.997
Gram-positive cocci Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae 182 Invalid Identification 1.670
Others Neisseria macacae Neisseria macacae 184 Neisseria mucosa 2.052
Nocardia nova Invalid Identification* - Invalid Identification 1.696

The isolates which was not correctly identified at the species level were indicated in bold.

*The protein spectra of the species were not included in the database.

†E. asburiae were reported as E. cloacae complex by ASTA MicroIDSys.

Abbreviation: ID, identification.

임상미생물 검사실에서 5년간 보고된 균동정 결과와의 비교

1개 종합병원의 임상미생물 검사실에서 2014년 9월부터 2019년 9월까지 5년간 세균배양 검사 에서 균종 동정 후 보고한 총 108,251건의 결과를 ASTA MicroIDSys 데이터베이스의 균주 목록과 비교하였다. 검사실에서 보고된 균속은 총 133속이었으며 균종은 총 401종이었는데, 이중 ASTA MicroIDSys의 데이터베이스에 포함된 균속은 120속(90.2%), 균종은 349종(87.0%)이었다. 그러나 5년간의 검사실에서 보고된 전체 동정 결과에서 데이터베이스에 포함되지 않는 균주의 비율은 균속 수준에서는 0.3% (373/108,251), 균종 수준에서는 1.4% (1,523/108,251)에 불과하였다. 본 연구 에서 확인된 ASTA MicroIDSys의 동정 일치율을 대입할 경우, 기존 보고 결과에 대해 균속 수준에 서는 99.7%, 균종 수준에서는 97.9%의 일치도를 보일 것으로 예측되었다(Table 6).

Table 6

Estimated identification results of ASTA MicroIDSys compared to the strains reported by Bruker Biotyper over the past five years

Year 2014 2015 2016 2017 2018 2019 Total
Reported strains 18,117 19,617 18,328 18,684 20,406 13,099 108,251
Estimated number of matched report (%)
Genus level 18,107 (99.9) 19,608 (100.0) 18,251 (99.6) 18,532 (99.2) 20,316 (99.6) 13,064 (99.7) 107,878 (99.7)
Species level 17,845 (98.5) 19,309 (98.4) 18,011 (98.3) 18,272 (97.8) 19,809 (97.1) 12,773 (97.5) 106,018 (97.9)

DISCUSSION

장내세균은 대부분 생화학적 분석 방법을 이용하는 자동화장비나 MALDI-TOF MS를 통해 비 교적 정확하게 균종 동정이 가능하나[24], Enterobacter 균속 등 일부 균종에서는 MALDI-TOF MS 의 균종 동정력에 한계가 있음이 보고된 바 있다[11-14]. 특히 E. cloacae의 경우에는 E. asburiae, E. hormaechei, Enterobacter kobei, Enterobacter ludwigii 등과 단백 구성 성분이 유사하여 MALDITOF MS 장비로 정확하게 구별되지 않는다고 알려져 있다[12]. 본 연구에서도 K. aerogenes나 K. variicola, E. hormaechei, R. planticola 등의 균종에서 두 장비 모두 소수의 균주이지만 동정 불일치 가 발생하였다. 장내세균에 대한 ASTA MicroIDSys의 균종 동정 일치율은 98.3% (411/418), Bruker Biotyper는 98.6% (412/418)였으며, ASTA MicroIDSys에서 균종 동정 결과가 일치하지 않았던 7 균주 중 6균주는 데이터베이스에 포함되어 있지 않았거나(4주), E. cloacae complex로 통합하여 보고하는 경우(2주)였다. Enterobacter 균속에 대해서 E. cloacaeE. kobei, E. asburiaeE. cloacae complex로 통합하여 보고하고 있었으며, E. hormaechei는 데이터베이스에 없었다. 추후 지속적인 데이터베이스의 보강을 통하여 균종 동정 정확도를 향상시켜야 될 것으로 판단된다.

Acinetobacter 균속은 가장 중요한 원내 기회 감염균 중 하나로 중환자실에서 폐렴과 패혈증 을 흔히 유발하며, 인공 장기 환자의 폐렴과 화상감염에서도 흔히 분리된다. 카바페넴 내성 Acinetobacter 균속은 다른 계열의 항생제에도 동시에 내성을 지닌 다제내성균인 경우가 많으며 사망률과 병원 입원기간을 현저히 증가시키는 것으로 알려져 있다[25]. 특히 우리나라에서 A. baumannii는 non-baumannii Acinetobacter 균종에 비해 카바페넴 내성률이 매우 높으므로, 임상미 생물 검사실에서는 Acinetobacter 균속 중에서도 A. baumannii를 정확히 구별해서 보고해야 할 필 요가 있다[26]. 본 연구에서 rpoB 유전자 염기서열 분석 결과와 ASTA MicroIDSys의 균속 일치율은 99.2% (118/119), 균종 일치율은 90.8% (108/119)였다. A. baumannii는 전체 Acinetobacter 균속 중 39.5% (47/119)였는데, 모두 정확하게 균속 동정 하였다. non-baumannii Acinetobacter의 경우 균 속 일치율은 84.7% (61/72)였고, A. baumannii로 잘못 동정된 경우는 없었다. 데이터베이스에 포 함되지 않은 균종을 제외하였을 경우, non-baumannii Acinetobacter의 균속 일치율은 96.8% (61/63) 로 증가하였다. 정 등은 Acinetobacter 균속을 대상으로 Bruker Biotyper의 데이터베이스를 개선하 여, 균종 동정 일치율을 높일 수 있었다고 보고한 바 있다[27]. 본 연구에서 ASTA MicroIDSys는 A. baumannii와 non-baumannii Acinetobacter 균종의 구별에 매우 높은 정확도를 보이므로, 임상에서 의 요구에 충분히 부합할 수 있을 것으로 생각된다

B. cepacia는 토양, 물, 동식물 등 주위 환경에서 발견되는 그람음성 호기성 막대균이다. 낭 포성 섬유증과 만성 육아종성 질환을 가진 환자에서 Cepacia 증후군(괴사성 육아종성 폐 렴과 이로 인한 균혈증)의 원인균으로 보고된 바 있으며, 카테터나 오염된 수액 또는 약제 를 통한 병원 감염 및 병원성 폐렴과도 관련이 있다[28,29]. BCC는 B. cepacia genomovar I과 B. cenocepacia Burkholderia ambifaria, Burkholderia anthina, Burkholderia dolosa, Burkholderia multivorans, Burkholderia pyrrocinia, Burkholderia stabilis, Burkholderia vietnamiensis를 포함하는 유전적으로 가 까운 9개의 균종으로 구성되어 있으며 이중 B. cenocepacia는 rpoB 유전자의 다형성을 갖는 4개 의 아형이 존재한다[30]. 따라서 BCC는 MALDI-TOF MS나 16s rRNA, rpoB 유전자 염기서열 분 석만으로는 균종 수준까지의 동정이 어렵고 hisA 또는 recA 등의 유전자 염기서열 분석을 통해 정확한 균종 동정이 가능한 것으로 알려져 있다[31]. 본 연구에서도 두 MALDI-TOF MS 장비 모 두 Burkholderia species의 균속명은 정확히 동정하였으나, 균종 일치율은 62.5%로 낮았으며, B. cepacia와 B. cenocepacia를 정확히 구분하지 못하였다. 따라서 MALDI-TOF MS에서 BCC에 해당 하는 균주가 동정된 경우에는 균속까지만 신뢰할 수 있는 동정 결과로 보고해야 하며, 해당 균주 에 대한 정확한 균종을 보고하려면 hisArecA 유전자의 염기서열 분석을 추가로 시행해야 할 것 으로 판단된다.

Candida 균속과 Nocardia 균속은 MALDI-TOF MS를 통해 비교적 정확한 동정이 가능하다고 알 려져 있다[32,33]. 본 연구에서도 Candida 균속은 두 장비간 동정 결과가 정확히 일치하였으나 N. nova는 두 장비 모두 정확한 균종 동정에 실패하였다. 다만, ASTA MicroIDSys는 해당 균종이 데 이터베이스에 없었으며, 수집 검체 중에서 Nocardia 균속이 1주 밖에 없어서 검체 상태나 균주 준 비와 관련된 우연 오차의 가능성도 배제할 수 없었다.

5년간 본원 임상미생물 검사실에서 Bruker Biotyper를 사용하여 보고되었던 총 401종의 균종 중에서 ASTA MicroIDSys의 데이터베이스에 포함되어 있었던 균종은 349종 (87.0%)이었다. 그러 나 이 장비를 실제 검사실에서 운영한다고 가정했을 경우 약 10만여 건의 동정 결과에 대해 ASTA MicroIDSys는 대부분의 주요 균종를 포함하여 97.9% (106,018/108,251)까지 동일하게 보고가 가 능한 것으로 예상되었다. Bruker Biotyper나 분자진단검사를 통한 균종 동정 결과와 불일치했던 대부분의 균종이 데이터베이스에 없었던 균종들이었고 데이터베이스에 포함된 균종들에 대해 서는 비교적 높은 일치율을 보였음을 감안하면, 임상미생물 검사실에서 흔히 보고되는 주요 균 종에 대한 분석 정보는 충실하게 반영되어 있는 것으로 판단된다

결론적으로, 최근 새로 출시된 MALDI-TOF MS 장비인 ASTA MicroIDSys는 환자 검체에서 분 리되는 임상적으로 중요한 대부분의 균종에서 높은 동정 일치율을 보여주었으며, 임상미생물 검사실에서 사용 가능할 것으로 판단된다. 동정에 실패하거나 불일치를 보였던 균종 대부분이 데 이터베이스에 없었던 경우였으므로, 데이터베이스의 확장을 통해 더욱 향상된 동정 성능을 갖출 수 있을 것으로 예상된다.

CONFLICTS OF INTEREST

No potential conflicts of interest relevant to this article were reported.

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