INTRODUCTION
카바페넴(Carbapenem) 항균제는 광범위 베타락탐분해효소 (extended-spectrum β-lactamase, ESBL)를 생산하는 그람음성 균 감염증의 치료에 널리 이용되고 있다[1]. 최근 ESBL 생성 그람음성균의 확산에 따라 카바페넴 항균제의 사용량이 증가 하였고 카바페넴 내성균 또한 증가하여 전 세계적으로 문제가 되고 있다[2]. 카바페넴 내성은 주로 Pseudomonas aeruginosa 와 Acinetobaacter baumannii 등에서 흔히 보고되었으나 최근 카바페넴 내성 장내세균(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)의 분리가 증가하고 있다[3]. 카바페넴 내성 기전 중 카바페넴 분해 효소의 생성에 의한 내성은 플라스미드를 통한 전이가 쉬워 집단발생 가능성이 높기 때문에 빠른 진단 및 지 속적인 감시가 필수적이다[4,5].
카바페넴분해효소 생성균(carbapenemase-producing Enterobacteriaceae, CPE)은 항균제 감수성 시험만으로는 CRE와 감 별할 수 없어 카바페넴분해효소 선별시험 및 확정시험이 필요 하다[6]. CPE는 modified-Hodge 시험(MHT) 및 carbapenemase 억제시험(CIT)을 통한 표현형 시험 또는 유전자 증폭을 통한 유전형 시험으로 검출할 수 있다. 표현형 시험의 경우 결과 확인이 주관적이고 내성 유전자 종류를 확인할 수 없는 단점이 있고 위양성의 가능성도 배제하기 어렵다[7,8]. 본 연구에서는 현재 알려진 주요 CPE 내성 유전자를 한번에 검출할 수 있는 multiplex PCR법을 개발하고 이를 평가하고자 하였다.
MATERIALS AND METHODS
본 연구에서는 카바페넴분해효소 생성 균주의 검출을 위하 여 국내에서 보고된 바 있는 KPC형, GES형, IMP-1형, VIM-2 형, NDM형, OXA-23형 및 OXA-48형을 대상으로 multiplex PCR을 고안하였다. GenBank의 데이터베이스에 등록되어 있 는 각 유전형의 염기서열을 수집하였으며 최종적으로 KPC 아 형 14가지, GES 아형 24가지, IMP-1 아형 12가지, VIM-2 아형 20가지, NDM 아형 16가지, OXA-23 아형 18가지, OXA-48 아 형 11가지를 대상으로 이들의 공통된 염기서열 부분을 이용하 여 primer를 고안하였다. 수집된 각 유전자의 염기서열을 이용 하여 7종의 CPE 유전자를 한번에 검출할 수 있도록 각 PCR 산 물의 크기를 설정하였다. 최종 증폭 산물의 크기는 각 유전자 별로 100 bp 이상 차이가 나도록 고안하여 배치하였고 각 primer 세트와의 교차 반응을 확인하기 위한 시뮬레이션을 수행 하여 시험관 내 반응 오류를 최소화할 수 있도록 하였다. Multiplex PCR의 증폭 조건은 임상검체에서 분리된 카바페 넴분해효소 생성 균주로 확인된 7주의 CPE 양성균주로 설정하 였다. 각 양성균주는 Tris-EDTA buffer 250 uL에 부유시켜 100°C에서 5분간 가열하였으며 −20°C에 옮겨 핵산을 추출하 였다. 추출된 핵산은 유전자 증폭 시험을 위해 사용 시까지 −70°C 초저온 냉동고에 보관하였다. Multiplex PCR은 AccuPower PCR premix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하였고 최적의 조건을 맞추기 위하여 Veriti 96-well Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 gradient PCR을 시행하였다. 2.5% Agarose gel에 100 V에서 40분간 전기영동 하여 증폭산물을 확인하였고 비특이적 반응 없이 가장 선명하고 정확하게 나온 조건으로 선정하였다
고안된 multiplex PCR의 성능을 평가하기 위해 총 69주의 카 바페넴분해효소 생성 균주를 이용하였다(Table 1). 시험대상균 주는 내성 유전자별 KPC 14주, IMP 13주, OXA-23 12주, OXA-48 11주, VIM 9주, GES 5주, NDM 5주가 포함되었다. 비특이적 반응 및 위양성의 확인을 위해 총 71주의 카바페넴 감수성 균주를 대상으로 평가하였다(Table 2).
Table 1
Table 2
RESULTS
본 연구에서 개발한 multiplex PCR에 포함된 총 7종의 카바 페넴분해효소 유전자의 primer 서열과 유전자 크기는 Table 3 과 같고 PCR 조건은 94°C 5분, 30회 반응(94°C 30초, 60°C 20 초, 72°C 30초), 72°C 7분으로 설정하였다. 본 연구에서 수행한 primer 및 PCR 조건으로 7종의 내성 유전자에 대한 확인 시험 을 수행한 결과는 Fig. 1과 같다.
Table 3
DISCUSSION
CRE의 주요 내성기전은 class A, metallo-β-lactamase (MBL, class B) 및 oxacillinase (class D) 카바페넴 분해효소의 생성에 의한 항균제의 불활성화이다. 특히 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), New Delhi metallo-β-lactamase (NDM), Verona integron-encoded metallo-β-lactamase (VIM), imipenemase (IMP), oxacillinase (OXA)-48 등의 발생이 증가하 여 문제가 되고 있다[11,12]. 국내에서도 CPE의 검출이 지속적 으로 증가하고 있으며 tigecycline과 colistin 등을 제외한 대부 분의 항생제에 내성을 보이는 등 다른 내성균에 비해 치명적이 고 확산 우려가 크기 때문에 2017년 6월부터 제3군 감염병으로 지정하여 전수조사를 시행하고 있다[13].
국가 또는 기관별로 차이가 있으나 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)에서는 카바페넴 항균제 중 한 가지 이상에서 중간내성 또는 내성인 균주를 CPE 선별기준으로 정 하고 있다[14]. MHT는 표현형 검사법으로 검사법이 간편하여 검사실에서 CPE 확정시험으로 널리 사용되고 있으나 CTX-M ESBL 또는 AmpC에 porin 소실이 동반된 경우 위양성을 보이 는 경우가 있어 특이도가 낮은 편이다[15]. CIT의 경우 카바페 넴분해효소 생성 그람음성균을 검출하기 위해 고안되었으며 MHT에 비해 민감도 및 특이도가 높은 장점이 있다.
분자생물학적 기법은 카바페넴 유전자를 정확하게 동정하는 표준시험법으로 PCR을 통해 정확한 유전형의 종류를 확인할 수 있으나 아직 표준화된 검사법이 없어 각 연구자들이 in-house PCR-based method법을 이용하고 있다. Poirel 등[16] 은 IMP, VIM, NDM, SPM, AIM, DIM, GIM, SIM KPC, BIC와 OXA-48 등 총 11개의 유전형을 3개의 반응물로 구성한 multiplex PCR법을 고안하여 보고하였다. 이 방법은 많은 종류의 유 전형을 검출할 수 있다는 장점이 있지만 PCR을 3번 수행해야 하는 번거로움이 있고 국내에서는 잘 발견되지 않는 유전형이 포함되어 있는 단점이 있다. 국내 질병관리본부에서는 Poirel 등[16]이 보고한 검사법을 변형하여 국내에서 검출되지 않는 유전형을 제외한 KPC, NDM, OXA-48, VIM 및 IMP가 포함된 multiplex PCR법을 소개하고 있다.
본 연구에서 개발된 multiplex PCR법은 질병관리본부에서 제안한 검사법에서 검출 가능한 5개 유전자에 추가로 OXA-23 과 GES를 검출할 수 있으며 primer를 새롭게 고안하여 총 7종 의 유전형을 한번에 검출할 수 있다는 장점이 있다. 국내 CPE 분리 빈도를 살펴보면 2012년 질병관리본부 조사 결과 총 44주 의 CPE 중 NDM-1, KPC, VIM, IMP, GES-5 등이 확인되었다 고 보고하였다[17]. 또한 Park 등[13]은 2014년 국내 CPE의 실 제 조사한 결과를 발표하였는데 GES-5 (0.6%), IMP (3.4%), KPC (23.6%), NDM-1 (21.3%), OXA-48 (2.3%) 및 VIM (11.5%) 등이 분리되었음을 보고하였다. 균종별로는 Citrobacter freundii (4.6%), Escherichia coli (4.0%), Enterobacter spp. (17.2%), Klebsiella oxytoca (8.0%), K. pneumoniae (59.8%) 등 이 높은 빈도로 분리되었음을 보고하였다.
질병관리본부에서 제공해주는 변형된 multiplex PCR법만으 로는 증가하고 있는 GES 유전형을 검출하는 데 한계가 있으며 이로 인해 더 많은 CPE를 놓칠 수 있다고 생각한다. 또한 CPE 에서 OXA-23형 유전자의 검출 빈도는 높지 않지만 내성 유전 자를 전달할 수 있는 특징 때문에 차후 검출률이 증가할 수 있 으므로 현재 질병관리본부에서 제안하고 있는 검사법의 보완 이 필요할 것이라고 생각한다.
최근 검사실 내 CPE의 빠른 진단을 위해 검체 내에서 바로 검출이 가능한 실시간 중합효소반응 검사법이 이용되고 있다. Check-Direct CPE (Check-Points, Wageningen, The Netherlands)와 CRE ELITe MGBⓇ (ELITechGroup, Puteaux, France)의 경 우 각각 4개의 유전형(KPC, OXA-48, VIM/NDM)과 5개의 유 전형(KPC, NDM, VIM, IMP, OXA-48)을 검출할 수 있도록 고 안되어 있다. XpertⓇ Carba-R (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA) 의 경우 미세유체칩이 적용된 카트리지를 이용한 실시간 중합 효소반응 검사법으로 KPC, NDM, VIM, IMP, OXA-48 총 5개 의 유전형을 검출할 수 있도록 고안되어 있다. 위와 같은 검사 법들은 검체 내에서 직접 유전형의 검출이 가능하기 때문에 균 주 배양 및 핵산 분리에 걸리는 시간을 단축할 수 있어 검사실 내 환자의 빠른 진단에 유용하게 사용되고 있다[18]. 본 연구에 서 개발된 multiplex PCR법은 균주를 배양한 후 핵산을 분리하 는 과정이 요구되기 때문에 위의 검사법들에 비해 검출 시간이 오래 걸린다는 한계점을 가진다. 이것은 차후 추가적인 연구를 통해 개선되어야 할 것이라고 생각한다
본 연구에서 개발된 multiplex PCR은 총 7종의 CPE 유전형 을 한 번에 검출할 수 있도록 고안되었으며 CPE에만 특이적으 로 적용 가능한 방법임을 확인하였다. 이러한 검사법의 활용은 매년 빠르게 증가하고 있는 CPE의 정확한 검출이 가능하여 원 내 감시체계 구축 및 감염관리에도 큰 도움을 줄 수 있을 것이 라고 생각한다.
요약
배경: 다양한 임상검체에서 카바페넴분해효소 생성 장내세균(carbapenemase-producing Enterobacteriace, CPE)의 분리가 증가하고 있다. CPE 감염증은 치사율이 높고, 집단 발병의 가능성이 높아 지속적인 감시가 필수적이다. 저자들은 CPE 주요 유전자들을 한 번에 검출하기 위한 multiplex PCR을 개발하고 이를 평가하고자 하였다.
방법: 총 7종의 내성 유전자를 동시에 검출하기 위한 시발체를 새롭게 디자인하고 PCR 조건을 설정하였다. 주요 카바페 넴분해효소인 KPC, IMP, VIM, NDM-1, GES, OXA-23 및 OXA-48 유전자를 대상으로 하였다. 각 유전자의 증폭 산물은 100 bp 이상의 차이가 나도록 고안하였다. 개발된 multiplex PCR은 총 69주의 CPE 양성 임상분리균주를 이용하여 평가하 고, 비특이적 증폭에 의한 위양성 가능성의 배제를 위해 71주의 카바페넴 감수성 균주로 확인하였다.
결과: 본 연구에서 개발한 시발체 및 PCR 조건을 이용하여 실험한 결과 CPE 내성 유전자인 KPC 양성 14주, IMP 양성 13주, OXA-23 양성 12주, OXA-48 양성 11주, VIM 양성 9주, GES 및 NDM 양성 각 5주 등 총 69주 모두에서 CPE 유전자 의 검출이 가능함을 확인하였다. 카바페넴 감수성 균주를 이용한 특이성 확인 시험에서 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa 등을 포함한 총 71주의 다양한 그람양성 및 음성균주 모두에서 음성임을 확인하였다.
결론: 본 연구에서 개발된 multiplex PCR은 총 7종의 CPE 유전형을 한 번에 검출할 수 있어 CPE 확인 시험에 유용할 것으로 생각한다. [Ann Clin Microbiol 2019;22:9-13]